Consilience

自從Peter G. Schultz從Science撤稿之後，大家就在等待他們是否可以證明用Unnatural amino acid Mutagenesis的方法來製造醣化蛋白質。不過現在要製造醣化蛋白質多了一個新方法，由馬里蘭大學跟瑞士ETH合作的一篇paper (Nature Biotechnology 2010)，他們將特殊基因導入大腸桿菌，促使大腸桿菌製造醣化蛋白質，其原理如下:

之前科學家一直以為蛋白質的 N-linked 醣化只會發生在真核生物，因此在利用大腸桿菌表現蛋白質時，是很難做 N-linked 醣化蛋白質的，後來科學家發現了一個會製造 N-linked 醣化蛋白質的原核生物，叫做空腸彎曲桿菌 (Campylobacter jejuni)，2002年時，ETH 的 Markus Aebi 實驗室將 Campylobacter jejuni 內負責醣化的酵素基因做成 plasmid 導入大腸桿菌，

使大腸桿菌製造出 N-linked 醣化蛋白質，並發表在Science (Science 2002, 1790 - 1793)。

然而這樣的方法只能做出Campylobacter jejuni 的醣序列 (GalNAcα1-4GalNAcα1-4(Glcβ1-3)GalNAcα1-4GalNAcα1-4GalNAcα1-3Bacβ1-NAsn)，跟原核生物的醣序列是完全不同的，如果將這種醣化蛋白質打入體內會引起強烈的免疫反應，因此限制了這個方法的應用。

不過最近他們找到解決辦法了，請看下圖:

在被植入 Campylobacter jejuni 基因的大腸桿菌中，醣鍊 (Glycan) 首先經由一些glycosyltransferase (PglC, PglA, PglJ, PglH and PglI) 被製造並連接在脂質上，形成 lipid-linked oligosaccharide (LLO)，然後 flippase PglK 會將LLO由細胞質翻轉到胞膜間區 (periplasm)，另一方面，在細胞質內做好的蛋白質也會經由Sec 或 Tat pathway而釋放到胞膜間區，之後oligosaccharyltransferase PglB就負責將醣鍊接到蛋白質上面而形成醣化蛋白質。

科學家就利用管住層析將這個在胞膜間區的醣化蛋白質純化出來，利用α-N-acetylgalactosaminidase切掉大部分的醣，只留下GlcNAc-tagged glycoprotein

最後，再用endo-β-N-acetylglucosaminidase將想要接的醣鍊接到這個蛋白質上，並且用MALDI-TOF質譜儀確定這個醣化蛋白質是否Homogeneous。

然而這個方法也是有缺點的，因為畢竟酵素都是有選擇性的，上述的oligosaccharyltransferase PglB只能認得D/EZNXS/T序列，有人會質疑是否這樣的方法也適用在其他蛋白質中，因此作者就試著去合成醣化抗體，將抗體上的一段 QYNST 換成 PglB可以辨認的DFNST，實驗證明，大腸桿菌可以做出此醣化抗體，但是也有些抗體沒有被醣化，經過上述的純化方法一樣是可以得到醣化抗體蛋白質。

所以假如這個方法要被廣泛的應用，還需解決一些問題，如果他們可以找到選擇性沒那麼好的oligosaccharyltransferase，可以將醣基接到任何蛋白質上，這個方法就完美了，否則每次都需要將被醣化的序列改成DFNST，那也未免太麻煩了。